Eine US-Forschergruppe entwickelt eine schnelle, hochsensitive und visuelle Nachweismethode für SARS-CoV-2. Das Verfahren ist vor allem für den Einsatz zu Hause oder in kleineren Kliniken gedacht.
Derzeit gilt die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) wegen der hohen Sensitivität und Spezifität als Goldstandard des Erregernachweises. Aber diese Methode erfordert teure Ausrüstung und geschultes Personal – beides wertvolle und knappe Güter in der Zeit einer globalen Pandemie. Doch der frühzeitige Nachweis des SARS-CoV-2 ist das A und O, um rechtzeitig zu intervenieren und eine weitere Verbreitung unterbinden zu können. Im Gegensatz zur PCR läuft das entwickelte AIOD-CRIPSR Verfahren von Biomedizintechnik-Forschern der University of Connecticut isothermal ab – also bei einer festen Temperatur.
Dabei hat es eine höhere Sensitivität und Spezifität als andere bereits existierende isothermale Amplifikationsmethoden. All-in-One-Dual CRISPR-Cas12a (AIOD-CRISPR) soll das Verfahren heißen. Die Hoffnung: Ein schneller, hochgradig spezifischer und nahezu einzelmolekülsensitiver isothermaler Nachweis – und das alles in einem einzigen Reaktionssystem.
Ein Mix verschiedener Ansätze
Doch wie sieht das Verfahren konkret aus? Im Ansatz enthalten sind zwei Cas12a-crRNA-Komplexe, zwei RPA-Primer zur isothermalen Amplifikation der DNA, DNA-Reporter, die bei entsprechender Spaltung fluoreszieren, Rekombinasen, sowie Einzelstrang-bindende Proteine (SBB), DNA-Polymerasen und die Zielsequenzen. Wenn dieses AIOD-CRISPR-System bei 37 °C inkubiert wird, läuft zunächst die Rekombinase-Polymerase-Amplifikation ab und die Bindestellen für die CAS12a-crRNA-Komplexe werden freigelegt. Haben diese Komplexe an die Zielsequenz gebunden, so spalten sie die nahgelegenen einzelsträngigen (ss-)DNA-Reporter, wodurch diese fluoreszieren. Ebenso können auch die Amplifikationsprodukte diesem Prozess unterzogen werden. Dadurch kann fortlaufend die CRISPR-Cas-12a basierte kollaterale Spaltaktivität an den Reportern ausgelöst werden und das Fluoreszenzsignal verstärkt werden. Dieser Effekt kann sowohl mit dem bloßen Auge unter LED-Blau- oder UV-Licht beobachtet werden, als auch per Realtime-Fluoreszenzmessung quantifiziert werden.
Um den Assay zu evaluieren, haben die Forscher insgesamt 8 Reaktionsansätze getestet und miteinander verglichen, wobei lediglich in Ansatz Nummer 5 – der als einziger alle Komponenten enthielt – nach 40 Minuten Inkubation bei 37°C eine Fluoreszenz festgestellt werden konnte. Die Reaktionsprodukte der Ansätze haben die Forscher anschließend noch mittels PAGE verifiziert. Auch hier konnte ausschließlich in Ansatz 5 eine Bande kürzerer DNA dargestellt werden, was für ein Spaltprodukt des ssDNA-Reporters spricht. In den anderen Ansätzen waren nur Banden längerer DNA sichtbar – hier wurde mangels verschiedener Komponenten der ssDNA-Reporter nicht gespalten und er konnte damit auch keinen fluoreszierenden Effekt zeigen. Abschließend führten die Forscher noch eine Realtime-Fluoreszenzmessung durch. Auch diese bestätigte die bisherigen Annahmen: Ausschließlich in Ansatz 5 konnte eine Fluoreszenz gemessen werden.
Durchführbar bei SARS-CoV-2?
Um dieses Verfahren nun auf den Nachweis von SARS-CoV-2 zuzuschneiden, nutzten die Forscher zunächst ein Plasmid mit einem 384 Nukleotide langem DNA-Abschnitt von SARS-CoV-2 als Zielsequenz. Bereits 1,3 Kopien des Plasmids konnten sowohl in der Realtime-Fluoreszenzmessung als auch in der visuellen Überprüfung innerhalb von 40 Minuten festgestellt werden. Anschließend wurde die Spezifität des Verfahrens für SARS-CoV-2 evaluiert. Hierfür wendeten die Forscher das Verfahren auf kommerziell erhältliche Kontrollplasmide von SARS-CoV-2, SARS und MERS an, um auch Kreuzreaktionen mit verwandten Viren auszuschließen. Abschließend transkribierten die Forscher mit einer T7-RNA-Polymerase die SARS-CoV-2 DNA aus dem Plasmid in RNA. Hierdurch wollten sie überprüfen, ob auch eine Detektion des Virus aus RNA-Material mittels reverser Transkriptase möglich ist. Tatsächlich bestand das Verfahren auch diesen Test: In 40 Minuten konnten bereits ab 4,6 Kopien der RNA von SARS-CoV-2 Fluoreszenzeffekte festgestellt werden.
Der AIOD-CRIPSR-Ansatz stellt ein Verfahren dar, bei dem alle Komponenten in einem einzelnen Reaktionssystem inkubiert werden können. Im Vergleich zu anderen CRISPR-basierten Verfahren läuft dieses isothermal ab. Darin liegt auch ein entscheidender Vorteil gegenüber der PCR, denn es bedarf keinen teuren Thermocycler. Es konnte gezeigt werden, dass der All-in-One-Dual CRISPR-Cas12a Ansatz prinzipiell durchführbar ist und dabei auch vielversprechende Ergebnisse liefert: Es scheint sehr schnell, sehr spezifisch und nahezu einzelmolekülsensitiv zu sein. Der Nachweis von SARS-CoV-2 ist sowohl aus DNA- als auch aus RNA-Material möglich. Ob sich das Verfahren auch im klinischen Alltag durchsetzen kann und im großen Stil umsetzbar wird, bleibt abzuwarten.
Autor: Charlotte Braatz
Quelle: © Ding et al. / Department of Biomedical Engineering, University of Connecticut Health Center
Bild: © Desertrose7 / Pixabay